HPLC和LC/MS 缓冲液选择指南：控制pH值
由于离子化化合物的保留对流动相pH非常敏感，因此需要添加缓冲液来控制流动相的pH值。
当添加少量酸或碱时，缓冲液会保持pH值。HPLC缓冲液中使用了许多不同的物质；部分添加剂会在表1中列出。
在pKa值上下浮动1个pH单位内使用时，缓冲液是最有效的；在pKa值上下浮动2个pH单位时，也可提供足够的缓冲。
表1. 常见的流动相添加剂1的pKa值
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pKa (25°C) |
化合物 |
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0.3 2.15 3.13 3.75 4.76 4.76 4.86 6.35 6.40 7.20 8.06 9.23 9.25 9.78 10.33 10.72 11.27 12.33 |
三氟乙酸2 磷酸(pK1) 柠檬酸(pK1) 甲酸 醋酸 柠檬酸(pK2) 丙酸 碳酸(pK1) 柠檬酸(pK3) 磷酸(pK2) 三异丙基乙磺酰 硼酸 氨 甘氨酸(pK2) 碳酸(pK2) 三乙胺 吡咯烷3 磷酸(pK3) |
HPLC紫外检测最常用的缓冲液是磷酸盐和醋酸盐。
磷酸盐和醋酸盐是非常有用的缓冲液，因为它们可以在低于220nm的波长下使用。
从表2可以看出，磷酸盐具有三个pKa值，可提供如下三个缓冲范围：1.1<pH<3.1，6.2<pH<8.2和11.3<pH<13.3（pKa可上下浮动1个pH单位）。
由于色谱柱的稳定性在实际使用时存在限制因素，我们需要将较低范围截断至2.0<pH <3.1，并消除最高范围。
请注意，磷酸盐的缓冲作用在pH为3.1和pH为6.2之间存在一个缺口。
这意味着，虽然可以将磷酸盐的pH值调节至5.0，但这个pH值下的缓冲能力可以忽略不计。
为了填补这个缓冲缺口，就需要另一种缓冲液。
由于醋酸盐的缓冲范围为3.8<pH<5.8，因此它刚好可以填补这一缺口。
如果略微扩展pKa的缓冲范围（上下浮动1个pH单位），磷酸盐和醋酸盐便可以覆盖通常用于硅基色谱柱的整个pH范围，即2<pH<8。
有时在方法开发过程中，您可能希望在色谱柱的有效范围内完全控制pH值。
在这种情况下，磷酸盐和和醋酸盐混合物可使流动相在2<pH<8的范围内连续变化。
一旦发现所需的pH值，就可以去掉不需要的缓冲液。
例如，如果最终流动相的pH值是4.3，那么醋酸盐就是所需的缓冲液，根本无需使用磷酸盐。
部分分析人员喜欢使用柠檬酸盐，因为它具有三个重叠的pKa值，可在2.1<pH<6.4的范围内提供缓冲（表2）。
但是，柠檬酸盐并不像醋酸盐和磷酸盐那样具有较低的紫外截止波长，所以它无法在220nm以下的波长环境下工作。
此外，一些分析人员发现，在使用柠檬酸盐时，止回阀会出现更多的问题。
因此，柠檬酸盐缓冲液通常是位于磷酸盐和醋酸盐之后的第二选择。
表2. 常见的HPLC缓冲液
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缓冲液 |
pH范围 |
LC-MS 兼容性 |
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磷酸盐(pK1) 磷酸盐(pK2) 磷酸盐(pK3) 醋酸盐1 柠檬酸盐(pK1) 柠檬酸盐(pK2) 柠檬酸盐(pK3) 三氟乙酸(0.1%) 磷酸(0.1%) 甲酸(0.1%) 甲酸铵 碳酸氢铵 硼酸盐 |
1.1 – 3.1 6.2 – 8.2 11.3 – 13.3 3.8 – 5.8 2.1 – 4.1 3.7 – 5.7 4.4 – 6.4 2.0 2.0 2.7 2.7 – 4.7 6.6 – 8.6 8.3 -10.3 |
X X X 是 X X X 是 X 是 是 是 是 |
