缓冲液可以使分析物保持在所需的pH值处。
如果您使用缓冲液是为了保持pH值，则仅需要很少的缓冲范围。
在分析工作中，许多样品都在 g/mL到ng/mL的范围内。因此，对于<100 L的注射，色谱柱上的质量将不超过几百纳克。
即使在缓冲液的pKa为1个pH单位的情况下，也仅需要很少的缓冲液来为样品提供所需的缓冲。
缓冲液也必须缓冲色谱柱，使其保持恒定的pH值。
由于大量的缓冲流动相通过色谱柱，所以固定相不断暴露于缓冲液中。
较新的高纯度硅胶色谱柱含有较少的酸性硅醇基团，因此与较旧的低纯度硅胶色谱柱相比，所需的缓冲液就较少。
图4的色谱图显示了该色谱柱的这一特性。（在这个应用中，三氟乙酸可以保持较低的pH值，也可以作为离子对试剂，所以这两种作用并不是相互孤立的）。
注意，在色谱图的左列中，当在流动相中添加0.1％的TFA时，可以比较所有三个柱的峰形。
如图4右侧的色谱图所示，当TFA的浓度下降10倍至0.01％时，硅胶纯度与峰形的相关性十分明显。而在0.1％TFA的情况下，高纯度硅胶柱的峰形略有降低，但中低纯度硅胶柱的峰形发生了急剧变化。
两组色谱图之间仅有TFA的浓度发生了变化。可以看出，TFA能够对色谱柱起到缓冲作用（至少部分有效），可将导致峰拖尾的强相互作用最小化。
当缓冲不足时，所有色谱柱的峰形都会变差。虽然大多数的新方法是基于高纯度B型硅胶开发的，但硅醇基的酸度在不同制造商之间有较大的差异。
但硅醇基的酸度在不同制造商之间有较大的差异。安全起见，应使用多于所需最小量的缓冲量。因此，在约0.1％v / v的范围内，我们推荐最终溶液中，酸性添加剂在约0.1％v / v的范围内，或者至少含有5-10mM的缓冲液。
最后，也是最重要的，注射缓冲液是为了缓冲样品，使其快速达到流动相的pH值。
很明显，在与流动相具有相同pH值的条件下，如果对溶剂注入少量样品，那么流动相缓冲液会更容易起作用；相反，如果与流动相的pH值相差过大，并对溶剂注入大量样品，将不会起到明显作用。通过在注射前调节样品的pH值，流动相则无需高浓度缓冲液。
图4 三氟乙酸的峰形效果
色谱柱：250x4.6mm, 5 m, C18 300Å。
条件：A：0.1%或0.01%的
TFA（溶于水中）；B: 0.1%或0.01%的TFA（溶于ACN）；30分钟内的5-70% B；1.00mL/min, 280nm。
成分（保留顺序）：核糖核酸酶A、细胞色素C、全铁转铁蛋白、脱辅基肌红蛋白。
