HPLC和LC/MS 缓冲液选择指南：溶解度
我们分析了注射和分离过程中需要多少缓冲液才能有效缓冲样品和色谱柱。
与此同时，还存在一个问题：使用上限是多少呢？
这里应注意一个关键问题：避免系统中产生缓冲液沉淀。
如果缓冲液在HPLC泵中产生沉淀，则需要大量的清洁工作才能将其清除，还需要更换部件。
而且，如果缓冲液在色谱柱内部产生沉淀，则应丢弃色谱柱，因为几乎无法从固定相的孔中清洗沉淀的缓冲液。
正如分析人员所熟知的那样，对于缓冲液和盐溶剂来说，乙腈（ACN）的效果比甲醇（MeOH）要差得多，而四氢呋喃（THF）则更差。
表3的数据已经显示了这一点，在pH为7.0时，可溶性最差的常见缓冲液是磷酸钾[2]。
当有机物为80%，溶于MeOH中的磷酸盐浓度为15mM，但在ACN中的浓度只有5mM；在80％THF中几乎不溶（<5mM）。
在含有50％有机物的流动相中，磷酸盐可溶于MeOH或ACN（其浓度>50mM），以及THF（25mM）。
也就是说，在等度分离时使用高有机物（％B）流动相或梯度结束在高％B。
必须注意避免缓冲液产生沉淀。
表3. pH为7.0时磷酸钾在普通HPLC溶剂1中的溶解度
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%B |
MeOH |
ACN |
THF |
|
502 |
>50 mM |
>50 mM |
25 mM |
|
60 |
>50 |
45 |
15 |
|
70 |
35 |
20 |
10 |
|
80 |
15 |
5 |
<5 |
|
90 |
5 |
0 |
0 |
表3所示的数据适用于本体溶液。
在线混合的效果可能会更差。无论是使用高压混合还是低压混合HPLC系统，当溶剂进入混合器时，A和B溶剂都会直接充分接触。
这可能会产生其它一些意外情况。鉴于这种情况，便需要含有10mM缓冲液的60％ACN流动相，这比表3中所示的60％ACN的45mM临界浓度要低得多。
如果A容器含有25mM缓冲液且B容器含有100％ACN，则A与B以40/60比例混合时，应足以满足所需的流动相。
但是，混合溶剂时，100％ACN接触25mM缓冲液后，可能会产生沉淀。
这可能造成很多问题，或者沉淀物也许会迅速重新溶解，具体取决于设备的设计特点。
所选的盐也会使溶解度出现显著的差异。
如表4所示，在可比条件下，磷酸铵盐在ACN中比钾盐更容易溶解。
醋酸盐比磷酸盐更易溶解。通常，考虑到溶解度的差异，最好使用钾盐而非钠盐。
表4. 不同缓冲液溶于乙腈的溶解度1
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%B |
醋酸铵 pH5.0 |
磷酸铵 pH3.0 |
磷酸钾 pH 3.0 |
磷酸铵 pH7.0 |
磷酸钾 pH7.0 |
|
602 |
>50 mM |
>50 mM |
>50 mM |
50 mM |
45 mM |
|
70 |
>50 |
>50 |
>50 |
25 |
20 |
|
80 |
>50 |
35 |
20 |
5 |
0 |
|
90 |
25 |
5 |
0 |
0 |
0 |
1 [2]的数据；2 当%B更低时，溶于所有溶剂的浓度>50 mM
