HPLC和LC/MS 缓冲液选择指南：稀释作用

对于配制包含缓冲液和有机溶剂的流动相，有几种方式可选。

对于等度工作，流动相可以手动混合，通过泵将其从单个容器中取用。

或者，使用HPLC系统混合组分。

浓缩的缓冲液可与纯有机溶剂混合，或者将稀释的缓冲液与含有相同浓度缓冲液的有机溶剂混合。

如果采用梯度洗脱法，只能使用最后两种技术（在等度或梯度系统中，A和/或B溶剂可以是水/有机混合物）。

每种混合技术各有利弊。由于手动混合法可以观察混合物的澄清度，并且能在使用前进行过滤，以去除沉淀，因此使HPLC系统出现缓冲液沉淀的可能性最小。
在线式混合方便等度方法的开发，并且也是梯度洗脱所必需的。

水状缓冲液与纯有机溶剂的混合十分简单，但存在两个潜在问题。首先，由于缓冲液被有机溶剂所稀释，所以A-溶剂的缓冲液浓度必须高于流动相所需的缓冲液浓度；其次，会存在缓冲液浓度反向梯度的情况。在缓冲液和有机溶剂最初于混合器中接触时，缓冲液浓度越高，越有可能产生沉淀。

在前述例子中，含有10mM磷酸钾且pH为7.0的60%的ACN可溶于本体溶液中，但A容器将需要25mM磷酸盐。当25mM磷酸盐在混合器中接触100％的ACN时，可能会产生沉淀。

混合上述溶剂的另一种方法是：将10mM的磷酸盐放入A容器中。对于B-溶剂，手动混合70％的ACN和30％的含有33mM磷酸盐的缓冲液，从而制备含有10mM磷酸盐的70％ACN（表3临界浓度的一半）。现在可以混合
A-和B-溶剂，从而获得60％ACN，其最终浓度将含有10mM的磷酸盐。

该技术可有效避免HPLC内部出现缓冲液沉淀的情况，并且可利用在线式混合方法，任意混合70％或更少ACN的流动相。

同时，缓冲液的浓度在整个梯度内恒定，所以在梯度过程中无需考虑缓冲液的稀释，使梯度洗脱更具优势。