样品稀释剂在HILIC中的重要性
引言
当使用亲水相互作用液相色谱法（HILIC）时，样品稀释剂的选择对峰形有显著的影响。稀释剂的错误选择可能会导致色谱峰形差，峰分裂和保留时间的不稳定。
这张ACE知识卡片探讨了在HILIC方法开发过程中如何确定合适的稀释剂。
样品稀释剂与峰形
理想情况下，HILIC模式下样品的稀释剂应该尽可能的接近分离化合物的流动相组成，即稀释剂由高比例的弱溶剂组成，如乙腈。对HILIC模式下梯度洗脱，样品稀释剂应该类似梯度方法流动相的起始条件。在某些情况下，可能会出现这种情况，极性化合物的样品溶解度问题：在HILIC中可能会遇到分析物相对不溶于高浓度的有机溶剂。
有时候，遇到HILIC峰形问题可以通过样品稀释剂的选择来解决。样品溶解在含高水稀释剂中是否为问题源头，因为水是强溶剂，洗脱能力强。样品被大量水包围，破坏了化合物分配到HILIC固定相表面富水层的机制。这就导致了化合物较差的峰形和保留时间的不稳定，尤其是保留较弱的化合物。图1 显示了2-脱氧尿苷分别用流动相和水做稀释剂获得的峰形图。当被分析物溶解在水里，观察到峰宽很大，几乎裂开的峰。通过用流动相来改变样品的稀释液，峰的形状和信号强度得到显著的改善。
HILIC色谱法，样品的稀释剂选择视具体应用而定，因此在方法开发中，应分配资源研究样品稀释剂的影响，通常是稀释剂的作用强度影响可能依赖于分析物，还受固定相和洗脱液的条件的影响。因此建议进行分步调查来探究提高有机溶剂的比例对于峰形和方法的影响。在50 - 90%乙腈中以增加10%的乙腈量增加：缓冲液可以帮助理解如何实现目标分析物的最佳峰形。
图1.样品稀释剂对于2-脱氧尿苷峰形的影响
色谱柱：ACE 5 HILIC-N, 150 x4.6mm.流速：1.5mL/min。流动相：10 mM 甲酸铵 pH4.7 in乙腈：水=9：1。进样量：5uL.。温度：25℃。 检测器：UV，254nm。
图2显示了在流动相pH 3.0 条件下，碱性、酸性和中性分析物的样品稀释剂对于三个ACE HILIC固定相（ACE HILIC-A、ACE HILIC-B、ACE HILIC-N）的影响的研究结果。样品稀释剂为乙腈和水的混合溶液，水的百分率介于0-100%之间。
次黄嘌呤（极性中性）的峰形一般随着乙腈浓度的增加而改善，最佳的有机溶剂含量在60-80%左右。酪胺(碱性)在低百分比有机相稀释剂条件下，HILIC-B和HILIC-N上出现分裂峰， HILIC-A峰形很差。当乙腈的浓度大于60%，峰形得到显著的改善。扁桃酸的峰形在HILIC-B和HILIC-N相上受稀释剂的影响较小，而对于HILIC-A相，在高水浓度下峰形较差。总的来说，从这个数据集合来看，对于这个应用，样品推荐使用由60-80%有机相组成的稀释剂。
图2：次黄嘌呤、酪胺和扁桃酸在（a）ACE 5 HILIC-N、（b）ACE 5 HILIC-A、（c）ACE 5 HILIC-B，150 x 4.6mm。在乙腈：水（90：10 v/v）甲酸铵调溶液pH 3.0。流速：1.5mL/min。温度：25℃。检测器：UV，254nm。进样量：5uL。
结论：
样品稀释剂的选择对峰形和方法有重要影响。一般来说，就是样本稀释剂应由尽可能高比例的较弱的流动相溶剂(HILIC模式中通常是乙腈)组成。应尽可能避免使用含高比例水的样品稀释剂。对于一个给定的应用，一个系统的样品稀释剂评估，可以帮助消除任何不良峰形的影响。
