反相色谱柱中污染物是怎样的形成？

1.色谱柱固定相的表面特征

大部分用于反相色谱的固定相是疏水性的，因此分析物是通过其与固定相之间的疏水作用的程度来进行分离的，含有疏水性组成的基团也有相似的保留行为。

残余的硅羟基存在于所有的硅胶键合相的表面。由于是弱酸的特性，这些硅羟基会同某些分析物相互作用，尤其是同一些碱性化合物。因为硅羟基的Pka值大约是在4.5左右。

同时，硅胶键合相的表面还会残留有金属离子，这些金属离子会在硅胶表面提供更强的酸性，同样还会起金属螯合作用使化合物保留变大。

大家可能会疑惑，金属离子的存在为什么会导致化合物的保留变大呢？

首先因为硅胶表面的金属离子会起鳌合作用，这样容易导致含有多个极性基团的化合物分子保留值变大。其次，靠近表面的金属离子会激活硅醇基团，使得硅醇基更容易和酸性或碱性化合物相互作用，从而导致化合物保留值增大、色谱峰拖尾。

2.色谱柱污染物的来源

色谱柱的使用者必须清楚色谱柱固定相的表面特征和可能存在的分析物与固定相表面发生的相互作用。

通常，样品基质里总是含有一些对分析者来说不感兴趣的化合物，例如盐类、脂质、含脂肪的化合物、疏水性的蛋白质和其他的一些生物化合物。它们可以通过检测器观察到，它表现为一些色谱峰、基线干扰，甚至是一些倒峰。

这些物质可能会比所需分析的物质有更强或更弱的保留能力。那些保留能力比较弱的化合物如盐类，将以死体积被洗脱出来。

如果样品基质组成在色谱柱中有强的保留性，且流动相组成本身就不强到足以使其洗脱出来，这些被吸附的、或是被吸收的化合物将会累积，通常是在经过多次进样之后堵塞在色谱柱的柱头。

这些吸附的样品组成达到了比较高的浓度，它们便表现为一种新的固定相。被分析物可与这些杂质作用并表现为新的分离机理。它可能会引起保留时间的变化和峰的拖尾。如果色谱柱受到了比较严重的污染，色谱柱的压力会达到一个无法承受的高度，这将会使泵超压工作，在堵塞的位置引起柱头的塌陷。

还有另一个情况需要注意，污染物并非来自样品或流动相，有可能来自仪器的密封圈碎屑。这些碎屑会随着流动相进入色谱柱，导致色谱柱堵塞。

3.定期清洗污染的反相色谱柱

清洗污染的反相色谱柱的频率依懒于有多少不明物质被注射到柱子中，因为反相色谱柱有时在分辨率损失和外来物质的洗脱前可以忍受大量的污染物, 使用者往往等到他们观察到一些异常现象才对柱子进行清洗。然而，长时间累积的污染物会使色谱柱的清洗工作变得更难。正因为如此，如果你知道自己的色谱柱很容易受到脏的样品基体的污染时，建议定期清洗你的色谱柱。清洗的次数越多，清洗条件也就越简单。

4.防止污染物进入色谱柱

最好的解决方法是预防，您将来可能会考虑使用在线过滤器或更佳的保护柱来保护分析柱。如果问题的根源是样品本身，则可以考虑对样品进行过滤或使用固相萃取去除污染物。

在线过滤器只是对色谱柱部分保护，他们有助于去除流动相中的颗粒物。颗粒来源于您的样品或者HPLC仪器的零部件。在线过滤器无法保护色谱柱免受小于过滤器的物质的污染，并可能吸附在填料表面。