做液相色谱分析时，可能会遇到以下难点：
1. 流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
2. 纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
3. 必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
4. 有机溶剂使用量。一般先用90%的乙腈或甲醇/水或缓冲溶液进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂的比例。每减少10%的有机溶剂的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。
5. 调整过程。当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
这些难点是液相色谱分析中需要注意和克服的方面，通过不断实践和积累经验，可以逐渐提高液相色谱分析的效率和准确性。
