高效液相色谱（HPLC）操作必看！

  高效液相色谱（HPLC）操作必看！

八大常见基础问题+解决方案

做HPLC时，你是否也遇到过流动相走空、基线乱飘、压力异常？一篇推文总结关键问题，助你实验顺利！

① 流动相未过滤 → 堵柱警告！

△ 问题：未过滤的颗粒物（如灰尘、盐结晶）堵塞色谱柱入口筛板，导致柱压升高、柱效降低、峰形拖尾或分叉。同时颗粒物进入泵头，磨损活塞密封圈，引发漏液或压力不稳，缩短泵寿命。

☑ 解决：

1、所有流动相用0.45 μm滤膜过滤（水相/缓冲盐用0.22 μm）。

2、水相缓冲液现配现用，冷藏防菌。

② 样品不过滤 → 柱子当场罢工

△ 问题：颗粒堵柱，峰分裂变宽。

☑ 解决：

1、样品必须过 0.22 μm滤膜。

2、控制进样量，别贪多。

③ 压力飙升/波动 → 哪里堵了？

△ 原因：高压：管路或柱堵塞；波动：气泡或泵故障。

☑ 解决：

1、高压：检查滤头(拆下用水进行超声)→管路(更换管路)→色谱柱(反向冲洗或换筛板)。

2、波动：流动相使用前要进行超声消泡，接通仪器后打开purge阀消除气泡，若问题还未解决则要进一步检查泵密封圈和比例阀。

④ 缓冲盐结晶 → 管路杀手！

△ 问题：盐结晶堵塞管路、泵或色谱柱，引发高压或流速异常；盐颗粒堆积破坏固定相，导致峰形拖尾或保留时间漂移；结晶物进入检测器，基线噪音增大或出现假峰。 

☑ 解决：

1、高盐流动相后，先用低有机相（5-10%）冲洗30分钟。 

2、避免盐与高有机相直接混合，流动相现配现用并过滤（0.22 μm）。 

3、长期停用前用纯水彻底冲洗系统，再纯有机相保存。

⑤ 流动相走空 → 泵抽空危机！

△ 问题：气泡进泵，会导致压力不稳甚至磨损柱塞、缸体或密封圈，最终产生漏液。

☑ 解决：

1、设置最低压力限报警。

2、留心关注流动相余量，勤补液。

3、抽空后：用异丙醇低流速（0.5 mL/min）排气泡。

⑥ 漏液 → 数据全崩！

△ 原因：接头松、密封圈老化导致漏液。

☑ 解决：

1、定期检查管路和泵头。

2、漏液立马停机，检查是否需要更换PEEK管或密封圈。

⑦ 保留时间漂移 → 重复性翻车

△ 原因：溶剂挥发或配比误差导致流动相比例变化；环境温度变化或温控失效影响分离效率；固定相流失或污染导致柱效下降；泵故障或比例阀误差引起流速波动；样品过载或污染改变保留行为。 

☑ 解决：

1、柱温箱控温，流动相现配现用防挥发。  

2、用高比例有机溶剂冲洗或换新柱。 

3、校准流速，维护比例阀和密封圈。 

5、用0.22 μm滤膜过滤样品，控制进样量。 

⑧ 梯度洗脱基线飘 → 溶剂背锅？

△ 原因：流动相未脱气；溶剂混合不均；温度波动；氘灯老化；流通池污染导致信号不稳；梯度结束后未充分平衡，流动相残留扰动基线。

☑ 解决：

1、使用在线脱气机或超声脱气30分钟。 

2、梯度前预混流动相，确保均匀性。 

3、开启柱温箱，维持恒温（±1℃内）。 

4、更换氘灯，定期清洗流通池。 

5、梯度后用初始比例冲洗5-10倍柱体积再进样。

记住：HPLC是细节控！

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