蛋白容易形成聚体的原因及解决方法

一、蛋白聚体形成的原因

结构不稳定、暴露疏水表面

蛋白本身结构不稳定或变性使疏水氨基酸暴露，与其他分子的疏水区域结合，促进聚集。

浓度过高

高浓度表达/纯化状态下，蛋白分子之间相互作用几率增加，诱导聚集。

不适宜的pH与盐离子强度

蛋白远离等电点（pI）时带电荷，极易因电荷中和/屏蔽而聚集。某些离子可稳定或破坏蛋白间作用。

氧化、化学修饰

半胱氨酸氧化，形成异常二硫键；甲硫氨酸、赖氨酸等被修饰，导致空间构象改变，进而聚集。

缺乏分子伴侣（chaperone）辅助折叠

原核、真核表达系统里，某些蛋白不易被正常折叠，误折导致包涵体（聚体）形成。

温度、剪切力等物理因素

剧烈震荡、冻融、加热均可造成蛋白变性和聚集。

长时间存放

蛋白随时间发生构象变化，聚集逐渐形成不溶或非功能性聚体。

二、蛋白聚体的解决方法

1. 优化表达与折叠条件

降低诱导温度：重组表达时（如大肠杆菌），降低诱导温度（如16–25°C），减慢折叠过程，减少包涵体。

降低表达量：调控诱导剂（如IPTG）用量，不要“大量暴力表达”。

加入分子伴侣：如GroEL/GroES、DnaK等辅助折叠，防止错误聚集。

2. 纯化过程优化

合理选择缓冲液：包含适当的pH、盐浓度、防止蛋白带电中和（聚集往往在等电点附近加剧）；如Tris、PBS、HEPES等。

添加防止聚集剂：加入甘油、蔗糖、盐（KCl、NaCl）、精氨酸、谷氨酸等常见稳定剂。

使用还原剂：如DTT、β-mercaptoethanol，防止二硫键异常交联。

加分子稳定剂：比如Triton X-100、Tween-20等非离子型表面活性剂低浓度使用。

3. 结构与纯度调整

点突变工程：针对疏水暴露、易聚集区，点突变为更亲水的氨基酸，如将暴露的Leu/Val/Met改为Ser/Asp等。

融合标签：如GST、MBP、SUMO等大标签有助于提高蛋白溶解性，减少聚集。

分步纯化/稀释浓度：降低浓度、或分做小批量，每步都加稳定剂。

4. 存储与处理改进

分装冻存，避免多次冻融。

低温保存（4°C/-80°C等），加甘油/蔗糖等保护剂。

避免剧烈搅动、强烈震荡。

5. 重新折叠处理

对于已形成包涵体的蛋白：

用高浓度尿素/盐酸胍变性，稀释下逐步除去变性剂，缓慢复性。

结合稀释、加入分子伴侣、小分子稳定剂等辅助复性。

三、实验判定与优化流程

用**SEC（凝胶过滤/体积排阻层析）**或DLS（动态光散射）分析蛋白单体/聚体比例。

SDS-PAGE判定不溶蛋白聚集。

逐步调整上述方法，检测蛋白活性与聚集比例。

小结：

蛋白聚体形成的主要原因是结构不稳定、疏水暴露、环境不适等，解决方法可通过表达参数优化、稳定剂添加、工程突变、适宜储存等进行改善。具体步骤根据蛋白类型和应用场景调整。