色谱分析（HPLC）故障排除1 - 峰形问题

峰形问题                                   

可能致因	预防措施/解决方案
峰拖尾
与活性硅醇的相互作用	使用超高纯度硅基（硅胶基质）固定相 添加碱性流动相添加剂（如TEA）- 超高纯度相则不需要
在固定相中与金属离子螯合	同上
错误的流动相pH值（流动相pH值不当）	降低流动相pH值以抑制硅烷醇电离 增加缓冲液浓度
玻璃料阻塞（筛板堵塞）	倒冲洗柱（反冲色谱柱） 使用串联（在线）过滤器
柱无效（色谱柱失效）	倒冲洗柱（反冲色谱柱） 更换柱 （色谱柱）
死体积未清扫（过大）	尽量减少连接器数量 使用较短的连接管 检查所有配件是否紧固
分裂峰
保护柱或分析柱入口（进样）端污染	拆下保护柱卡套（卸除保护柱芯）并进行分析 - 必要时更换保护柱 倒冲洗（反冲）分析柱 对于顽固残留（强保留污染物），应尝试再生法（对色谱柱进行再生） 更换柱
玻璃料阻塞 （筛板堵塞）	倒冲洗柱（反冲色谱柱） 使用串联（在线）过滤器
样品溶剂与流动相不兼容	在流动相中注入样品 （用流动相溶解样品）
同时洗脱第二组分	注射前使用样品清理 （进样前先净化样品） 通过改变流动相或柱相（色谱柱固定相） 来改变选择性
柱超载（色谱柱过载）	使用更高容量的固定相 增加柱的直径 （增加色谱柱内径） 减少样本（样品）量
伸舌峰
柱中通道的形成 （色谱柱内形成通道）	更换柱 （色谱柱） 在建议的色谱柱（色谱柱建议的）pH值范围内操作
柱超载 （色谱柱过载）	注入更少量或更稀释的样品溶液 （减少进样体积或进一步稀释样品） 使用更高容量的固定相
样品溶剂与流动相不兼容	在流动相中注入样品（用流动相溶解样品进样）
低温	增加柱的温度 （升高柱温）

1. 峰形
1.1.在RP-HPLC应用之初，峰拖尾就是最常见的峰形问题（拖尾峰是RP-HPLC自出现以来最普遍的峰形问题）。

大多数峰拖尾是由于柱内硅胶颗粒表面上的酸性或离子化硅烷醇基团之间相互作用而导致的。

低纯度硅胶（通常称为“A型”或酸性硅胶）具有高含量的酸性硅烷醇（-Si-OH）基团，其富含的金属杂质（特别是铁和铝）可提供阳离子交换位点，进一步促使这些基团电离成-Si-O-。

这些材料的pKa在pH4-5区域中，这意味着在pH>6时，大部分硅烷醇基团会被电离（已离子化）。

通过提高纯度并降低硅胶的酸度可获得更高纯度的硅胶颗粒（“B型”），并且自引入（其出现）以来，这些硅胶填料的纯度已经得到了改善（有所提高）。

高纯度硅胶的pKa> 8，因此对于大多数色谱柱，在2 <pH <8的稳定范围内仅有微量的硅烷醇被电离。
碱性化合物极易受到硅醇拖尾（影响而导致拖尾），并且由于大多数样品分子含有碱性氮官能团，所以没有多少（很少有）化合物可以完全对硅醇交互作用免疫（不受硅醇基的影响）。

图1显示了硅醇拖尾的情况。甲苯是一种中性化合物，不会产生硅醇拖尾现象，但图1中剩余（其他）的分析物为强碱性药物。

流动相pH值是6，这是影响分离的另一个因素，它会使纯度较低的硅胶色谱柱出现硅烷醇离子化现象（对于该分析更大的挑战在于流动相pH=6，这一条件下低纯度硅胶色谱柱的硅醇基已离子化）。

低纯度硅胶（“A型”硅胶）（图1a）会与碱发生强烈的相互作用，致使分析物不会从柱上洗脱下来（以至不能从色谱柱中洗脱这些分析物）。

早期的B型材料（图1b）显着改善了峰形，尽管它们均出现严重拖尾现象，但样品中的所有峰形均可见（可以看到样品中所有分析物出峰）。

通过进一步改善（提高）硅胶纯度（图1c），可使峰拖尾降低至可接受的水平。

只要在RP-HPLC中使用含硅烷醇的硅胶，就不可能消除峰拖尾现象。

虽然使用高纯度硅胶色谱柱是改善硅烷醇拖尾的最佳办法，但仍存在其它解决拖尾现象的技术（技术可以减少拖尾）。

近年来，多采用将三乙胺（TEA）（一种小（低）分子量碱）加入到流动相（例如25mM）中的方法改善峰拖尾。

TEA是酸性硅烷醇基团的有力竞争者，但对于当今的高纯度硅胶，几乎无需或很少使用TEA。

图1：

图1. 硅胶纯度和峰拖尾(a) 低-、(b) 中-、和(c) 高-纯度硅胶。
色谱柱：250x4.6mm, 5m；

流动相：80:20 MeOH/25mM KH2PO4(pH 6.0)；
流量：1.0 mL/min；

成分：1, 去甲麻黄碱；2, 去甲替林；3, 甲苯；4, 丙咪嗪；5, 阿米替林。

1.2.缓冲液或流动相添加剂不足也会导致峰拖尾。

缓冲液主要用来使样品处于（保持）恒定的离子化状态，从而稳定保留情况（时间），并在最大程度上减少因离子相互作用而导致的峰拖尾现象。

缓冲液还可抑制硅胶表面上的硅烷醇基团的电离现象（的硅醇基离子化）。

但是对于低纯度硅胶材料来说，由于其硅烷醇更容易被电离，所以它的挑战性更高（当然，这对于低纯度的硅胶材料是更大的挑战，因为可能更多硅醇基会离子化的）。

添加剂浓度对峰形的影响如图2所示。

在这种情况下，三氟乙酸（TFA）会作为蛋白质样品成分的离子对试剂，也会产生（可提供）低pH流动相以抑制硅烷醇电离。

通常，0.1％TFA可以（作为添加剂）用于蛋白质和肽分离。

如图2a和b所示，该浓度足以在最大程度上改善高纯度和中纯度硅胶柱的拖尾现象。

然而，如果TFA浓度下降（降低）十倍（图2c，d），两个相（两个固定相）的拖尾均会随之增加。高纯度硅胶仍可（仍然）保持可接受的峰形，但中纯度色谱柱的峰拖尾则无法接受。

缓冲液和其它流动相添加剂的一个共同特征是：作用效果（例如峰拖尾的减少、保留时间的稳定）会从低浓度开始（开始显现），并随着浓度的增加而继续作用（增加），但会逐渐（趋平）维持在一个稳定水平。

稳定水平之下的添加剂浓度，可以保持稳定的运行；浓度过高会产生（可能导致）溶解性问题。

对于大多数应用来说，10-25mM内的添加剂已经足够了，但最好根据具体情况确定。

图2. 缓冲液浓度对峰拖尾的影响。

0.1％TFA与（a）高纯度（b）中纯度硅胶柱；0.01％TFA与（c）高纯度和（d）中纯度硅胶柱。

色谱柱：250x4.6mm, 5m, C18 300Å；

流动相：A: 0.1%或0.01%的TFA溶于水中；B: 0.1%或0.01%的TFA溶于ACN；5-70% B，30分钟；

流量：1.0 mL/min, 280nm。

成分（保留顺序）：核糖核酸酶A、细胞色素C、全铁转铁蛋白、脱辅基肌红蛋白。

1.3.色谱图中所有峰拖尾或峰变形通常是由物理作用导致的，而非化学作用。

如果色谱图中的峰形均表现相同类型的变形（图3），则问题最早应出现在分析物通过色谱柱迁移之前（主要问题发生在分析物在色谱柱中迁移之前）。

这种峰形变形最常见的致因是：玻璃料或柱头的空隙部分堵塞（此类峰变形最常见的原因是筛板部分堵塞或色谱柱头塌陷）。

除非在推荐的pH范围之外使用色谱柱，否则现在的柱子基本不会受到空隙的影响（轻易不会发生塌陷）。

但是，玻璃料（筛板）堵塞仍然是一个普遍存在的问题。对于5m颗粒柱（的色谱柱），入口端的玻璃料（筛板）通常具有2.0m的孔隙度；对于（颗粒）3m的色谱柱，具有0.5m的孔隙度。
如果颗粒物来自于样品，或颗粒物是因泵密封磨损或流动相到达色谱柱而产生的（磨损的泵密封圈或者流动相颗粒物进入色谱），它们通常会集中在玻璃料上（都聚集在筛板上）。

这些颗粒会影响样品在色谱柱入口端的分流，使得部分样品通过不同的流动路径到达色谱柱，因此会晚于另一部分样品。
由于此时（此位置）未发生分离，因此所有分析物会以相同的方式变形（被扰乱），进而色谱图显示所有峰均具有相似（类似）的峰拖尾或变形。

为了防止（避免）这一问题，如果流动相可能含有颗粒（如缓冲沉淀物或灰尘），应对其进行过滤；并在泵密封严重磨损（导致颗粒物的产生）之前更换新的泵密封（密封圈）。

如果样品含有颗粒碎片（屑），应对样品进行过滤（例如0.5m孔隙度过滤器（微孔滤膜））或对其进行短暂离心（例如5分钟，>1500×g），以去除颗粒。

我们强烈建议在自动进样器下游（之后）安装0.5m孔隙度的串联（在线）过滤器，以过滤任何意外进入HPLC系统的颗粒物。如果串联（在线）过滤器玻璃料（滤片）发生堵塞，系统背压会升高；而更换玻璃料（滤片）十分简单、快速和经济。采用串联（在线）过滤器可显著延长色谱柱的使用寿命，而且经济实惠。

图3. 由于玻璃料或色谱柱空隙被部分堵塞（色谱柱筛板部分堵塞或色谱柱塌陷），色谱图中所有峰形均出现了变形。

1.4.如果峰形解析不正确（未完全分离的重叠峰），可能会被误认为柱（色谱柱）或缓冲液的问题。

如果仅部分解析两个峰形（两个峰仅有部分分开），则可能会认为其是裂峰或双峰。如图4显示的情形。

在图4a中，可观察到与图3极为类似的峰值变形（峰变形），其表明玻璃料被堵塞（筛板堵塞）。

改变柱并未纠正这个问题（更换色谱柱不能解决此问题），所以玻璃料（筛板）堵塞并非导致这一现象的原因。如果柱上样品的质量减少（减少上样量）（图4b），峰形看起来更像是两个峰，而不是一个肩形峰。

这便需要进一步研究，以确定是否存在第二个峰。可以通过修改方法条件来完全分离两个峰（由此进行了进一步的研究，证实了存在第二个峰。

调整方法的条件后，两个峰完全分离）。

图4. 由于存在第二个组分而产生分裂峰。

（a）25ng / mL，和（b）等离子体中10ng/ mL的药物（第二个峰）（10 ng/mL血浆中的药物（第二个峰））。来源[1]。

1.5.由于目前的色谱柱性能优良，因此极不可能出现伸舌峰（伸舌峰的现象随着现今柱填充技术的提高已相当少见）。

伸舌峰一般是由柱过载或柱结构塌陷导致的（发生伸舌峰的一个原因是色谱柱内发生沟流或色谱柱结构的坍塌）。

如果在制造商推荐的条件下使用色谱柱，这种情况则很少发生。

大多数硅胶柱在pH2-8的范围内可以保持稳定。

pH低于2时，键合相会发生水解；pH高于8时，硅胶会溶解。

如果（如果您需要）在此pH范围以外使用（操作）HPLC系统，请确保选择在选定条件下会保持稳定的色谱柱。

图5显示了因柱过载（色谱柱发生沟流）导致的伸舌峰。

图5a中显示了正常的峰值形（峰形）;在大约500次注射（进样）后，观察到伸舌峰（图5b）。

使用这种方法便会出现这种变化，并且在每次运行的过程中会经常出现（这种改变是该方法所特有，经常在前一次分析结束后，下一次分析开始时突然发生）。

出现伸舌峰后，唯一有效的解决办法就是更换色谱柱。

该柱为100x2.1mm（直径（内径）），色谱柱填充5mC18颗粒（柱内填充5μm 粒径的C18填料） 。流动相A是10mM碳酸氢铵（pH9.0） ； B是甲醇（MeOH）。

该方法包括5％B等度洗脱段，接下来是80％B的冲洗（然后用80%B淋洗）。

这种特殊的色谱柱可专门用于高达100％的水流动相，且无封端。

当流动相pH值升高时，封端可保护硅胶免于溶解。

在这种情况下，所使用的色谱柱流动相pH应远高于推荐的范围，并且无需保护性封端。硅胶在pH为9时会逐渐溶解，直到柱床结构不再稳定，并且柱床会发生移动，
产生空隙（塌陷）或通道，而这又会导致图5b伸舌峰的形成。

可以使用较低的流动相pH或采用在较高pH下能够保持稳定状态的色谱柱，以避免这一问题（避免这一问题）。

图5. 过载导致的伸舌峰。（a）正常的峰形；（b）伸舌峰。来源[2]。