温度的影响 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南
柱温和流动相温度会以两种方式影响多肽的分离。
随着温度上升，保留值会略微降低。
但更重要的是，肽对的相对保留值（选择性）取决于温度。
选择性随温度的变化影响分辨率，且在一系列多肽分离的优化中，温度是重要因素，如蛋白酶水解蛋白质期间产生的多肽。
温度在一系列合成肽分离中的作用如图23所示。
随着温度的增加，多肽保留值略有下降，但更重要的是，肽对间的分辨率随着温度的变化而变化。
因此，在多肽的分离中，控制柱温和流动相温度很重要。
此外，温度还是肽分离优化的重要变量，尤其是肽图谱中的分离。
温度会显著影响肽图谱中多肽的分离，如图24所示。
该示例为从人生长激素的胰蛋白酶水解物中分离多肽，增加柱温不仅影响肽的选择性，还会造成洗脱顺序的逆转。肽7和8在较高温度下的分辨率更高。
肽11~13的最佳分离温度为40°C，温度提升至60℃会出现肽11和12的共洗脱峰。
肽14和15的最适分离温度为20°C，肽15先出峰。
温度升至40℃时会使肽14先于肽15洗脱。
温度升至60℃时会提高肽14和15的分辨率。
在肽图谱中可以明显看出柱温对分辨率有显著的影响。
图23. 多肽保留值随着温度的增加而降低。更重要的是，温度影响相对保留值或选择性，进而影响分辨率。
条件
色谱柱：C8，2.1 x 150 mm
流动相：0~30% 乙腈—0.05% TFA体系，梯度洗脱，60分钟。
样品：合成螺旋多肽和非螺旋多肽
图24. 通常，蛋白水解产生多肽的相对保留值会受到温度的影响。
条件
色谱柱：C8宽孔柱，4.6 x 150 mm
流动相：0~60% 乙腈—0.1% TFA体系，混合梯度洗脱，60分钟。
样品：人生长激素的胰蛋白酶水解物
与多肽分辨率相比，蛋白质分辨率受温度的影响较小，但温度较高时，蛋白质的峰形和回收率均有所改善，特别是大分子蛋白或疏水性蛋白。
在环境温度下，单克隆抗体图谱的峰形较差，但当温度升高时，峰形会有明显改善（图25）。
通常在高温下用色谱法分析大分子蛋白或疏水性蛋白的效果最佳。
图25.温度对反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析重组单克隆抗体的影响。
条件
色谱柱：C8 宽孔柱，3.5 微米，4.6 x 150 mm
流动相：混合液梯度洗脱：20-90% 乙腈-0.1% TFA体系
样品：重组单克隆抗体
